DNA模板、PCR体系以及扩增条件等因素都会对PCR反应产生影响，我们将这些常见问题及可能原因、对应的解决办法归纳如下表：常见问题可能原因解决问题无扩增产物模板含有抑制物或含量低纯化模板、使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量Buffer 对样品不合适更换Buffer 或调整浓度引物设计不当或者发生降解重新设计引物(避免链问二聚体和链内二级结构)或者换一对新引物退火温度太高，延伸时间太短降...
Agarose抑制DNA与吸附材料的结合，将不含DNA片段的Agarose切除，能显著提高回收效率。DNA结合到吸附材料，需要一定浓度的结合剂，Agarose多了，结合剂(Solution Sn) 的相对浓度就会下降，回收率就受到影响。大多数情况下，由于电泳时琼脂糖的浓度不同，切下的胶块有大有小，得率自然不同。回收的得率还与回收片段的大小有关，提高结合剂的相对浓度，增加DNA与吸附材料作用时...
我们将限制性内切酶酶切的常见问题、可能原因及解决办法归纳如下表：常见问题可能原因解决办法DNA 完全没有被等内切酶切内切酶失活标准底物检测酶活性DNA 不纯，含有SDS ，酚，EDTA 等将DNA 过柱纯化或乙醇沉淀DNA条件不适(试剂、温度)检查反应系统是否最佳DNA 酶切位点上的碱基被甲基化换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解， 重新将质粒DNA 转化至dcm-，dam-基因型的细菌菌株...
①菌液OD值偏大或偏小②原始菌株不好③试剂超纯程度不够④操作时，对菌体伤害过大。影响感受态效率的最重要的因素就是:菌的状态。控制OD就是为了使菌的生长状态达到对数期，此时菌活力最高，处理时要保持这种好的状态，但又要被CaCl2处理充分，使膜局部变化达到最佳的感受状态。从这个意义上说，任何可能影响菌状态的步骤或试剂均有可能最终影响到感受态的转化效率，比如离心力大小、CaCl2的纯度、浓度及处理...
可能感受态细胞转化效率太低，用质粒作为阳性对照检测感受态的转化效率；可以尝试提高载体或插入片段的纯度，对于平端连接需注意适当延长连接时间；可能载体酶切不够充分，用未经连接的载体转化作为阴性对照；连接体系不合适，如连接酶可能失活或活性下降，更换新的连接酶及Buffer；连接条件不合适，温度或反应时间不合理，请仔细参照连接酶的产品说明书。
有时RNA或cDNA模板中存在对反转录和荧光定量PCR反应的阻害物质。为了确认这样的阻害物质的有无，我们可以使用高浓度的模板按3-4个梯度稀释，并使用其进行荧光定量PCR反应。如果无阻害物质存在，得到的Ct值就会依模板浓度的变化而变化；而如果模板中有阻害物质的存在，实验过程中我们就会发现高浓度的模板有反应性能下降的现象。
当进入对数期的循环数大于35时，Real-Time PCR检测无效，基因没有表达; 当进入对数的循环数在32-35个循环时，需要有至少3个重复才能判断是否能检测到基因的表达。
反应循环数不够:一般都要在32个循环以上，可根据实验情况增加循环数，但高于45个循环会增加过多的背景信号;检测荧光信号的步骤有误:一般采用72℃延伸时采集荧光， Taqman方法则一般在退火结束或延伸结束采集信号;引物或探针降解:可通过PAGE 电泳检测其完整性;探针设计不佳:设计探针退火温度低于引物退火温度，造成探针未杂交上而产物己延伸;模板量少:对未知浓度的样品应从系列稀释样品的最高浓度...
可能的原因有：更换了不同的培养液或血清；培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨眈肢或生长因子等耗尽或缺乏或己被破坏；培养物中有少量细菌或真菌污染；试剂保存不当；比较新培养液与原培养液成分，比较新血清与旧血清等，找出其它可能的原因。解决办法：增加起始培养细胞浓度；让细胞逐渐适应新培养液；换入新鲜配制培养液；补加谷氨酷肢或生长因子等；用无抗生素培养液培养，如发现污染，去弃培养物，或用抗生素除菌；血清...
无血清培养基( serum 企ee medium，SFM):是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生民繁殖的合成培养基，但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。基本成分为基础培养基及添加组分两大部分，添加组分可能包括纤连蛋白、层粘连蛋白等贴壁因子、胰岛素、转铁蛋白、硒等。
低血清培养基中酌红的含量与普通培养基中的酣红含量不同，不能通过肉眼观察或通过经验来判定pH值，建议使用pH计进行测定。
如果细胞培养基偶然被冻，您应该自然溶解培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生，培养基可以正常使用，如果出现沉淀，只能丢弃这些培养基。
实验显示，经过正确处理的热灭活血清对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至因为高温处理影响了自洁的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血洁，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显做镜下观察像是"小黑点常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在3TC 环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。...
冷冻保存方法一：冷冻管置于4℃(30-60分钟)→-20℃(30分钟)→-80℃(16-18小时或隔夜) →液氮罐长期储存。冷冻保存方法二：冷冻管置于程序阵温机中每分钟降1-3℃至80℃以下，再放入液氮中长期储存。注意-20℃不可超过1小时以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入80℃冰箱中，但存活率会稍做降低一些。
FBS(fetal bovine serum)和FCS(fetal calf serum)是相同的意思，两者都是指胎牛血洁，FCS乃错误的使用字 眼，请不要再使用；CS(calf serum)则是指小牛血清；HS(horse serum)则是指马血清。
解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃)，非常容易产生沉淀物；解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生；请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分会因此受到损害，而影响血清的质量；血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤；若必须...
不见得！因为胰蛋白酶溶液的消化能力是和溶液的pH、温度、胰酶浓度及溶液中是否含有Ca2+，Mg2+和血清等因素有关。通常情况下，pH8.0，温度37℃其作用能力最强。另外，钙、镁离子及血清均能大大降低其消化能力。在每次进行传代消化前，一定要用D-Hanks液或PBS液反复冲洗细胞培养瓶，以便于将含血清的培养基冲洗干净，这样就能大大提高消化液的消化能力。通常使用的消化液浓度为：0.25%胰蛋白...
二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来整合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。
体外培养的细胞大多具有生长接触抑制的特性，也就是说当一个细胞被其他细胞包围的时候，它就会停止生长，及时传代后，细胞的生长得以继续。
研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，原因比较复杂，常见原因可归纳为:培养基使用错误或培养基品质不佳；血清使用错误或血清的品质不佳；解冻过程错误；冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心；悬浑细胞误认为死细胞；培养温度使用错误；细胞置于-80℃太久等。建议严格参照ATCC或ECACC 的标准操作规程进行细胞复苏、冻存等工作。
