配置 4% PFA(多聚甲醛)
试剂配制
1) 900 ml dd H20 + 500 ul 1N NaOH /*一定要加点NaOH,否则超难溶解*/
2) Heat to 65-70℃
3) While stirring, add 40 g paraformaldehyde
4) Continue heating and stirring until paraformaldehyde is dissolved
5) Let cool to room temperature
6) Add 100 ml of 10X PBS
7) Adjust pH to 7.3 with HCl
8) Sterile with filter
9) Store at 4℃, protected from light
4%多聚甲醛(PFA)配制:
1) 称取40gPFA溶于装有500mlDEPC水的玻璃容器(烧杯或烧瓶)中,持续加热磁力搅拌至60-65℃,使成乳白色悬液。
2) 用1.0mmol/L 的NaOH调PH至7.0使呈清亮状(滴加),再加入约500ml 2×PBS,充分混匀(在冰浴或冷水浴中)。
3) 可再检测一下PH,过滤后定容至1000ml,室温或4℃(保存备用)。
注意事项:
1.配制时应在通风条件下操作,并避免接触皮肤及吸入(戴口罩及手套),因PFA有较强的毒性,对粘膜及皮肤有刺激作用。
2.加热时,温度不可过高,常为60-65℃。否则PFA降解失效,配制好的PFA虽可有效一点时间,但过久的液体,固定效果下降,应用前新鲜配制。除了用DEPC水配制PFA外,也可以用灭菌蒸馏水或经DEPC处理的0.01-0.1%/L的PBS配制,方法及主要事项同上。
3.固定细胞常用3.7% PFA。
4.不宜长时间保存,最好现配现用。在4℃保存不宜超过1星期。
参考文献:
1. Lanuti, P., et al., A flow cytometry procedure for simultaneous characterization of cell DNA content and expression of intracellular protein kinase C-zeta. J Immunol Methods, 2006. 315(1-2): p. 37-48.
2. Lin, H.J., et al., Phosphonoformic acid-inhibitable nucleotide incorporation as a measure of hepatitis B viral DNA polymerase activity. J Med Virol, 1983. 12(1): p. 61-70.
