RNA干扰主体实验
shRNA表达载体构建好后，即可进行RNA干扰主体实验。
RNA干扰主体实验的重点在于：
- 成功将shRNA表达载体导入目的细胞。
如果目的细胞的质粒转染效率较低（低于70%），则应采用腺病毒或慢病毒载体，利用病毒载体的高感染率、高表达特性，更好地开展RNA干扰主体实验。
- 设置好分组和对照。
详情见【TIPS：RNA干扰实验中的对照】。
- RNA干扰效率的检测（体外）。
一般应该从mRNA水平、蛋白质水平、细胞表型水平三个层次来检测干扰效率。
- mRNA水平：RT-PCR、Real-time PCR；
- 蛋白质水平：Western-blot、ELISA、免疫组化；
- 细胞表型水平：MTT、克隆形成实验、流式细胞检测、细胞小室实验等。
- RNA干扰效率在动物模型上的进一步验证（体内）。
动物模型实验可以采取“体内法”和“体外法”。
- 体内法，即先做裸鼠成瘤模型，再将质粒或病毒导入裸鼠，检测RNA干扰效果。此法操作复杂，对质粒和病毒产品的质和量要求都较高，但是比较贴近实际，说服力较显著。
- 体外法，即先将质粒或病毒导入肿瘤细胞，再将肿瘤细胞导入动物体内，然后检测RNA干扰效果。此法操作较简单，对质粒和病毒产品的质量要求较低，所以为大多数文献所采用。建议采用此方法来进行动物模型水平的实验。
TIPS：RNA干扰实验中的对照
按照nature的标准，一个严格的RNAi介导knockdown实验要有6个对照：
- 转染试剂对照（监控转染及培养条件对结果的影响）；
- nonsense siRNA对照（监控外源核酸本身对结果的影响）；
- positive siRNA对照（监控假阴性）；
- 技术重复对照（也叫off-target 对照，也就是利用至少2个靶点的siRNA同时实验，2个siRNA互为off-target control，当两者的表型相同时，才有可能是特异性的knockdown效应）；
- rescue 对照（knockdown之后做超表达，看是否有性状的逆转，这也是为了说明knockdown的特异性）；
- 全表达组扫描对照（就是转录/表达芯片扫描，以最终确定表型不是由于off-target造成）。
实际实验中，全表达组扫描对照很少有文献涉及。其它几个对照中，（1）（2）两种对照即所谓的空白细胞对照、NC对照，基本是所有杂志都要求具备的。（4）（5）两种对照，主要是为了解决off-target效应，选做一种即可，一般建议选（5），涉及的实验即所谓的“RNA干扰回复实验”，本公司针对这一实验，有专门的“RNA干扰回复实验套餐（S4008）”，详情请参见相关内容。
RNA干扰主体实验（细胞水平）（S4006）服务价格及周期
| 项目 | 价格 | 周期 |
|---|---|---|
| 预实验 | ||
| 确定目的细胞质粒转染效率 | 500元 | 1周 |
| 确定目的细胞腺病毒 感染效率 | 500元 | 1周 |
| 材料准备：质粒形式 | ||
| shRNA表达载体构建 | 1500元/条 | 2~3周 |
| NC对照 | 免费 | 现货 |
| 转染级质粒大提（100ug） | 200元/个 | 2~3天 |
| 材料准备：腺病毒形式 | ||
| 腺病毒包装 | 5000元/个 （滴度为109pfu/ml左右） | 4~5周 |
| rAd-NC腺病毒对照 | 1000元 （滴度为109pfu/ml左右） | 1~2周 |
| RNA干扰实验 | ||
| 细胞培养 | 根据细胞类型而定， 150~300元/瓶 | 1周 |
| 细胞转染 | 50元/瓶 | 2~3天 |
| 腺病毒感染 | 免费 | 2~3天 |
| RT-PCR检测 | 500元+200元/样本 | 1周 |
| Western-blot | 500元+200元/样本 （不包一抗，免费提供二抗） | 1~2周 |
| MTT | 1000元/株细胞 | 1周 |
| 流式细胞检测 | 300元/样本 | 1周 |
| 克隆形成实验 | 2000元/株细胞 | 1~2周 |
| 细胞小室实验 | 询价 | 1~2周 |
| 其它实验 | 询价 | |
（注：部分内容可选做。）
RNA干扰主体实验（动物水平，体外法）（S4007）服务价格及周期
| 项目 | 价格 | 周期 |
|---|---|---|
| RNA干扰主体实验 （动物水平，体外法） | 1000元/只裸鼠 | 1~3周 |
| 成瘤大小 | ||
| 免疫组化 | ||
| 其它实验 | 询价 |
（注：裸鼠分组一般包括空白组、NC组、RNA干扰组，每组做3~7只裸鼠）
客户须知：
- 进行RNA干扰主体实验前，最好先通过预实验确定目的细胞的质粒转染效率。如目的细胞的质粒转染效率大于70%，则可采用质粒形式载体；如目的细胞的质粒转染效率低于70%，则建议采用腺病毒。如目的细胞的质粒转染效率低于70%，而客户坚持使用质粒形式的载体进行RNA干扰主体实验，则本公司不保证shRNA的干扰效果。
- 如shRNA序列由客户提供，或shRNA序列由本公司提供，但未在本公司进行有效shRNA筛靶实验，本公司不保证所采用的shRNA一定有效。
- Western-blot实验中，如一抗采用国产抗体，本公司不保证一定会获得正结果。
本公司保证所提供的实验数据真实、准确，但不保证实验结果一定符合客户预期。